（一）载体构建阶段

克隆失败原因

酶切不完全：

避坑：优化双酶切条件，纯化后电泳验证片段大小 。

案例：插入片段与载体连接效率低时，需重新设计引物或更换酶切位点 。

连接效率低：

优化：控制插入片段与载体摩尔比，延长连接时间。

假阳性克隆：

验证：必须通过菌落 PCR 和测序确认插入片段。

Gateway兼容载体

L4440-Gateway 在 EcoRV 位点插入重组盒，可通过 BP/LR 反应快速克隆，避免传统酶切-连接 ：

优势：简化克隆流程，适合高通量筛选。

注意：需在 PCR 引物中引入 attB 位点 。

（二）细菌转化与诱导

感受态细胞制备

关键步骤：

使用 CaCl₂法 制备 HT115 感受态细胞，冰浴 30 min 。

热激温度 42℃/90秒。

复苏后涂布含 Amp（100 μg/mL） + Tet（12.5 μg/mL） 的 LB 平板 。

试剂信息

英文名称：L4440 Vector

载体用途： 线虫RNAi干扰载体

载体大小： 2790bp

原核抗性： 氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）

克隆菌株： DH5α

启动子： T7

复制子： pUC

质粒标签：lacZN, OriF1

表达宿主：线虫

诱导方式： IPTG

5'测序引物： 根据全序列设计

纯度：≥95%

储存条件：-20℃避光干燥

生产厂商：西安强化生物科技

（一）

载体骨架：L4440是pBluescript质粒的改造版本，长度约2790 bp，属于高拷贝数质粒。

核心元件：

反向T7启动子：位于多克隆位点两侧，驱动DNA双链同时转录，生成互补RNA形成dsRNA。

多克隆位点（MCS） ：185 bp区域，含多种限制性酶切位点，用于插入目标基因片段。

筛选标记：氨苄青霉素抗性基因，用于细菌转化后的阳性克隆筛选。

复制起点（ori） ：支持高拷贝复制。

升级版本：新版本在T7启动子上游添加终止子，减少非特异性转录。

（二）功能机制

dsRNA生成：目标基因插入MCS后，在IPTG诱导下，宿主菌的T7 RNA聚合酶从两侧启动子转录，生成互补RNA链并形成dsRNA。

RNAi干扰原理：线虫摄食含dsRNA的细菌后，dsRNA通过肠道吸收，触发RNAi通路沉默目标基因表达。

Carboxy-PTIO(cPTIO)

Tide Fluor 7叠氮化物

BXQ-1 CPG (1000 A)

AzoDye-3 CPG (500 A)

Azo Dye-3 PEG 10 炔烃

MitoTEMPOL线粒体靶向SOD模拟物

AP219 (Control Compound for AP39)

PE-iFluor 594 Tandem PE-iFluor 594

PE [R-Phycoerythrin] CAS 11016-17-4 PE

MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator

Rosetta-gami 2(DE3) Chemically Competent Cell

TOP10 Electrocompetent cell 大肠杆菌电转感受态细胞

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本试剂用于科研领域，其他用途概不适用！